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實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的測(cè)量原理包括以下幾個(gè)方面

瀏覽次數(shù):420發(fā)布日期:2024-01-09
  實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒是用于實(shí)時(shí)定量PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)的試劑盒。實(shí)時(shí)PCR是一種通過(guò)檢測(cè)靶基因熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程的技術(shù)。測(cè)量原理主要包括以下幾個(gè)方面:
 
  1.DNA擴(kuò)增:實(shí)時(shí)PCR試劑盒中包含了DNA聚合酶,其能夠與反應(yīng)體系中的模板DNA結(jié)合,并在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行DNA鏈的合成和擴(kuò)增。
 
  2.靶基因檢測(cè):加入了與目標(biāo)基因序列相對(duì)應(yīng)的引物(primer)和探針(probe)。引物是一種短的DNA片段,能夠與目標(biāo)基因的特定序列互補(bǔ)結(jié)合,從而在PCR反應(yīng)中起到引導(dǎo)DNA合成的作用。探針是一種含有熒光染料和熒光信號(hào)猝滅物(quencher)的DNA序列,其與目標(biāo)基因的特定序列互補(bǔ)結(jié)合后,熒光信號(hào)被猝滅,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
 
  3.熒光信號(hào)檢測(cè):在實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中,擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸增加,同時(shí)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,使熒光信號(hào)減弱。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀器可以在每個(gè)PCR循環(huán)后測(cè)量熒光信號(hào)的強(qiáng)度,根據(jù)熒光信號(hào)的變化可以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。實(shí)時(shí)PCR儀器一般會(huì)設(shè)置閾值來(lái)判斷是否存在目標(biāo)基因,當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)閾值時(shí),表示PCR反應(yīng)中存在目標(biāo)基因。
 
  4.定量測(cè)量:通過(guò)測(cè)量PCR循環(huán)次數(shù)(CycleThreshold,CT值)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因定量。CT值是從熒光曲線中判斷的某一點(diǎn),即在此點(diǎn)上熒光信號(hào)超過(guò)閾值。CT值越小,說(shuō)明目標(biāo)基因的起始模板數(shù)量越多,反之則起始模板數(shù)量較少。通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,可以計(jì)算出樣本中目標(biāo)基因的初始數(shù)量。
 
  實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的應(yīng)用非常廣泛,包括:
 
  1.基因表達(dá)分析:可以檢測(cè)和定量分析特定基因在不同組織、細(xì)胞或時(shí)間點(diǎn)中的表達(dá)水平。
 
  2.突變檢測(cè):可以用于檢測(cè)和鑒定DNA序列中的突變或基因突變體。
 
  3.微生物檢測(cè):可以用于檢測(cè)和鑒定病原微生物、細(xì)菌或病毒的存在和數(shù)量。
 
  4.基因拷貝數(shù)定量:可以用于檢測(cè)和定量分析基因的拷貝數(shù)變化,如染色體異常等。
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